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    阿尔茨海默病啮齿类动物模型的制备方法

    点击次数:55 发布时间:2019-08-30

    一、衰老动物模型

     AD多发于老年人。衰老是AD肯定的危险因素。随着世界人口的老龄化,AD的患病率显著上升,已成为成人的第4位死因,于是出现了以衰老作为AD发病基础的动物模型。

    (一)自然衰老认知障碍动物模型

    通过动物本身的自然衰老来获得的AD动物模型,包括老龄大鼠、小鼠及猴等。这类模型的认知障碍等神经系统改变是自然发生的,更贴近AD的真实病理生理改变。Cummings等报道老龄犬脑中有Aβ沉淀斑块,同时有相应的选择性的行为能力损害;Higgins等报道老龄鼠可出现Aβ沉积于前脑基底区,并有记忆缺损。但这些模型一般不出现AD的SP与NFT等特征,且易死亡。

    (二)快速老化小鼠模型和神经原纤维缠结

    通过对AKR/J自然变异小鼠进行近交延代培养得到一种自然快速老化小鼠(senescence accelerated mouse, SAM),该家族诸多品系中的SAM P/8和SAM P/10表现出明显的学习记忆功能减退,处于一种低紧张痴呆状态。

    (三)D-半乳糖诱导的大、小鼠亚急性衰老模型

    给药后的动物中枢神经系统出现一系列退行性变化,如海马锥体细胞数量减少、皮质神经元蛋白质合成减少、脑组织中超氧化物歧化酶活性降低、丙二醛含量升高。表现出学习记忆能力下降、认知障碍、行动迟缓、毛发稀疏等老化征象。但此类模型同样也未出现NTF及老年斑样改变。

    二、胆碱能损伤动物模型

    哺乳动物脑内前脑基底区胆碱能神经元、海马和皮质及它们之间的通路是学习记忆功能的重要结构基础。AD患者前脑基底区胆碱能神经元大量损伤或死亡、突触前乙酰胆碱的合成、ChAT(胆碱乙酰转移酶)的活性及对胆碱的摄取能力都明显下降,这些变化的程度与患者认知功能损害的程度呈正相关,因此人们通过各种方法来破坏动物大脑的胆碱能系统。促使其发生学习记忆障碍而达到制作AD动物模型的目的。

    (一)电损毁、外科损毁模型

    参照动物脑立体定位图谱,用电灼伤的方法损毁Meynert基底核,外科手术切断海马-穹隆伞。破坏胆碱能及非胆碱能纤维传入,导致实验动物行为及神经化学方面的缺损,造成动物空间定向和记忆障碍及胆碱能神经元的丢失。但病理上未出现老年斑和NFT。1994年,Jeltsch等的实验研究结果表明,切断双侧海马穹隆伞通路造成的AD模型在数月后其行为及神经化学的缺失也不能恢复。用此方法建立AD模型周期短,但手术定位难以控制,很难避免手术区邻近组织的受损。

    (二)化学损毁模型

    将鹅膏蕈氨酸、喹啉酸、海仁酸注入大鼠Meynert基底核可建立AD模型,此法可造成胆碱能神经元减少、皮质ChAT活性降低,但不破坏通过此区域的神经纤维。术后海马神经细胞明显减少、学习记忆能力下降。但AD神经递质缺乏是广泛性的,此类模型只模拟了胆碱能功能减退的特征,并未复制出其他递质功能减退的表征,且模型也同样未出现AD的典型病理改变——老年斑和NFT,因此制模时仍需在应用药物种类、剂量、作用部位及时间等方面进一步观察。

    (三)以Aβ为基础的动物模型

    脑内Aβ由淀粉样蛋白前体物质(amyloid precursor protein, APP)经一系列酶的降解而来。APP是体内广泛存在的一类跨膜蛋白质,APP在体内有两种代谢途径:①经由p-分泌酶、γ-分泌酶催化,在712位残基附近断裂产生对细胞有毒性的Aβ;②APP经α-分泌酶和γ-分泌酶催化产生可溶性的APPa(sAPPa)。值得注意的是,α-分泌酶从Aβ分子内部进行分解。避免了完整Aβ序列的产生,且sAPPa对神经细胞可产生营养、保护作用。而Aβ过度产生后沉积于脑内,引起钙稳态失调,激活胶质细胞释放大量炎症介质、氧自由基,最终导致广泛的神经元变性、凋亡、突触缺失。故认为Aβ沉积是AD发病的中心环节,因此出现了多种以Aβ为基础的模型,同时也带来了新药物作用的靶点。将合成的Aβ注射到动物脑内可产生Aβ的聚集和神经毒性作用。通常注入微量的可溶性Aβ,并没有明显的短期的神经毒性作用。但如果注入的量很大,则促使Aβ聚集。当Aβ聚集后,容易观察到Aβ沉积或淀粉样变。胆碱能神经元凋亡、突触结构减少。小神经胶质细胞及局部星形胶质细胞被激活。Nitta等将100Pg的Aβ注入大鼠脑室后,发现大鼠出现了行为障碍,如被动回避反射及水迷宫学习障碍。如果每天将2μg的Aβ通过导管注入海马内,15d后大鼠也会出现行为障碍。这些模型说明沉积与行为(学习、记忆)障碍有关。但注射Aβ的动物模型存在三方面不足:首先,会导致一个穿透性的脑损伤;其次,无法研究Aβ本身形成的病理过程;最后,注入的Aβ量很大则有一定的操作难度,因为在注入之前Aβ就很容易聚集,而控制聚集又将给在损伤部位以外的脑内得到大量散在的Aβ增加困难。

    (四)铝中毒诱导痴呆模型

    人们发现外界环境危险因素在AD发病中也占有重要地位,因此建立了铝元素慢性中毒的AD动物模型。早在1937年Scherp和Church就提出铝可引起神经元退化的看法,1965年Klatzo等提出铝中毒可能与AD发病有关,他们发现在AD患者与铝中毒患者脑中均可看到NFT。此后1937年Grapper等提出铝可能是神经毒素,他们给猫脑内直接注射铝盐。发现铝具有神经毒素样作用,导致神经纤维变性。国内有学者采用给大鼠或小鼠腹腔注射及口服铝盐建立模型,结果模型鼠出现大脑质量减小、学习记忆能力减退的表现。临床资料表明,AD患者脑内铝含量显著高于正常值;血清铝的水平也显著高于对照组。综观有关铝与AD发病关系的实验研究,可以基本肯定:AD患者脑内铝的含量明显超过正常值:铝对中枢神经系统有毒性损害,使神经元变性或死亡,产生NFT病理性改变,继而表现为大脑皮质萎缩,脑质量减小,出现记忆、认知功能障碍。总之,用铝诱导建立AD模型的方法较好,不足之处是此种AD模型出现的NFT与AD患者略有差异,并且用铝造模周期长。

    (五)缺氧所致的动物模型

    研究发现AD患者实际上长期处于慢性缺氧状态。通过剥夺啮齿类动物的供氧,可诱导与老化脑功能相似的能量代谢障碍。由于老化和缺氧都能损害氧化代谢,并可导致相似的行为障碍,因此缺氧和老化可能有一定的相似性。该模型是先训练动物一次性被动回避性行为,然后立即放入缺氧的环境中,动物可出现逆行性记忆保留障碍。实验性缺氧动物模型与老年啮齿类动物在神经化学和行为学方面相似,因此可用于评价实验研究和治疗老年性记忆障碍的药物。这种动物模型简单而经济,可用于开发记忆障碍药物的临床前筛选。该模型的主要缺点是缺氧动物模型与不同神经递质(包括胆碱能系统)的神经病理学改变广泛相关,而不能表现出AD的脑区特异性胆碱能神经受损;另一个缺点是此模型缺乏与 AD脑内相似的组织病理学特征。

    (六)tau蛋白过度磷酸化模型

    研究表明,AD患者脑中沉积的Aβ通过抑制细胞对葡萄糖的摄入和利用而引起神经细胞退化,导致患者记忆能力减退。而在糖尿病和Apo E4携带者的AD高发人群中。也会出现神经细胞葡萄糖摄入率降低的现象,且用葡萄糖和胰岛素合并治疗能明显改善AD患者的记忆能力。基于此,近些年出现了tau蛋白AD样磷酸化模型。用一次性大剂量链佐星(streptozotocin, STZ)腹腔注射或STZ合并高脂饮食诱发小鼠糖尿病或使小鼠禁食引起神经细胞对葡萄糖的摄入和利用降低,使神经细胞内tau蛋白的N-乙酰氨基葡萄糖糖基化水平降低,游离出潜在的磷酸化位点。tau蛋白更易磷酸化。过度磷酸化改变了tau蛋白的结构和构象,最终引起微管结构崩解,形成大量的NFT结构。

    (七)实验性自动免疫性痴呆模型

    皮下注射纯化的Torpedo胆碱能神经元中的高分子质量神经丝蛋白(NF-H),使大鼠产生持续免疫,引起室中隔和海马神经元中IgE沉淀,神经元的密度降低,大鼠的认知功能损害,表现为短期工作记忆、空间和位置分辨障碍,这种动物模型称为实验性自动免疫性痴呆(EAD)。这种动物模型可复制AD的某些病理形成过程。也证明了抗胆碱能NF—H抗体在 AD神经元变性中发挥一定的作用。

    (八)转基因动物模型

    AD是一种多基因的疾病,现已知的主要致病基因有4个:APP基因、PS-1基因、PS-2基因和ApoE4基因。近年来,转基因动物取得了很大成功。APP基因是最早发现的AD致病基因。APP在体内通过β-分泌酶、p-分泌酶和核内溶酶体系统降解产生淀粉样蛋白。Hsiao用朊蛋白(pHon)启动子转入瑞典家族性AD的KM670/671NL突变基因,获得了APP的过度表达。观察到明显的跟年龄相关的淀粉样沉积和伴随记忆缺陷的脑内Aβ增加。Hsiao在报告中还提到APP FVB鼠和SOD转基因鼠杂交可以显著延长寿命,使其有足够的时间形成Aβ沉积。Sommer等用Thyl转入携带瑞典家族性AD突变基因的APP751变异型。1年后这些小鼠也出现了沉积的淀粉样变斑块。Chen等进一步证实了过度表达FAD的 APP717密码子突变的小鼠能形成除NFT外大部分AD的病变:淀粉样斑块的沉积、神经炎性斑、突触和树突蛋白的丢失、细胞骨架成分的异常磷酸化、溶酶体淤积、急性时相蛋白、反应性的星形小胶质细胞等,同时还表现出了显著的学习和记忆障碍。Ps蛋白家族和一部分早发性家族性AD有密切关系。把PS-1转基因鼠和Hsiao的T92576APPsw转基因鼠杂交,可以增加Aft42的水平,但有关该模型的病理改变尚在进一步的研究之中。Chui研究了PS-1转基因鼠。发现13个月以后(老龄鼠),神经元变性显著加速,虽然没有淀粉样斑块的形成,但有大量神经元出现细胞内Aft42沉积。

    在AD患者脑内发现有增高的TGF-β,Wyss Coray建立了过度表达TGF-8的转基因鼠, TGF-β诱导脑血管和脑膜上的A3沉积;APP和TGF-β的双转基因鼠中,Aβ沉积也被加速了。Beeri将人类胆碱酯酶(AChE)基因转入小鼠体内并使其在大脑神经元内过度表达,获得了比对照组高2倍的AChE活性。这种鼠表现出进行性发展的学习、记忆障碍。

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